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基因修改总算比及诺贝尔化学奖!两位女科学家斩获,为何没有张锋

撰文 | 返朴

北京时间10月7日晚,2020年诺贝尔化学奖颁给了Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna,以赞誉其在基因修改方面作出的奉献。

获奖人简介:

Emmanuelle Charpentier博士,法籍微生物学家,现为德国马克斯·普朗克研讨所感染生物学研讨所所长。在CRISPR的开展中,其首要的奉献在于发现Cas9蛋白的活性仰赖tracrRNA。

Jennifer A. Doudna博士,为伯克利大学化学和分子生物学与细胞生物学教授,霍华德休斯医学研讨所的研讨员,美国国家科学院院士。她与Emmanuelle Charpentier博士一起发现Cas9 的切开作用和,crRNA 的定位作用,并将crRNA与tracrRNA能够交融成单链引导RNA。

相关范畴专家剖析称,华人科学家张锋首先在真核细胞内选用CRISPR-Cas9完成基因修改,但他未能获奖,或许是因为张锋的作业原创性要低一些,他的奉献更像最初细胞重组中科恩和伯耶的奉献;而且化学奖更重视体外试验成果,他的打破首要体现在细胞方面。

CRISPR已经是现在生物医学方面十分遍及的的基因修改技能,近几年该技能的飞速开展,推广运用到了生物、医学、农业以及环境等多个范畴,造就了一批批科研奇观,尤其是在遗传病的医治、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤医治以及动植物的改造、病原微生物防治等范畴有着巨大的潜力,也将深远地影响整个国际。

1. 什么是CRISPR

CRISPR的全称是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,中文翻译为“规则成簇的距离短回文重复”。这个词的字面意思便是“代表了同一类特征显着、牌子规整、次序一起的重复序列”。它作为细菌的适应性免疫体系,当外源病毒或质粒DNA进入细胞时,专门的Cas蛋白会将外源DNA剪成小片段,并将它们粘贴到本身的DNA片段中存储。当再次遇到病毒侵略时,细菌能够根据存储的片段辨认病毒,将病毒的DNA堵截而使之失效。

科学家运用CRISPR的这一功用,将其改造成为一种革命性的新式分子东西。因为它具有精准的定位和切开任何品种的遗传物质的才能,使得科学家能够更称心如意地破解地球上任何生物 (包含人类) 的生命暗码。

2. CRISPR 简史

图1:CRISPR开展简史

CRISPR的发现与命名

早在1987年,日本大阪大学的Nakata研讨组在剖析大肠杆菌时就发现,细菌中存在一些反常重复的序列。但其时人们并不知道这些重复序列终究有什么作用,乃至还没有正式为这些重复序列命名。直到20世纪80年代末,西班牙阿利坎特大学的Francisco Mojica再次在一种古菌种发现了相似的重复序列,这引起了他极大的爱好。在随后的研讨中,他一直在微生物中寻觅相似结构,到2000年他已经在20多种不同的微生物种中发现了这一相似的序列。2002年,荷兰乌得勒支大学的Ruud Jansen发现不同物种的重复序列碱基数存在巨大差异,而且这种序列仅存在于原核生物中。为了更好地标准相关的研讨,他们一起为这种重复序列命名为“CRISPR”。。多个CRISPR相关基因则被命名为Cas宗族。

CRISPR-CAS体系的生物学作用

2005年,CRISPR研讨迎来了一个重要发现,两个研讨小组都调查到了CRISPR重复序列之间的距离序列并非来自于原核生物本身,而是来源于质粒或病毒。因而,Mojica提出CRISPR是一种适应性免疫体系的假定。同年,Bolotin研讨组在嗜热链球菌中发现了Cas9,并猜测这个巨大的蛋白质具有核酸酶活性。他们还发现与病毒同源的距离序列都具有一品种似的尾巴,称为PAM序列,它们对靶序列的辨认至关重要。

遭到这一假说的激起,其时还在闻名的酸奶公司Danisco作业的法国微生物学家Rodolphe Barragou决议对其进行验证,以处理嗜热链球菌迸发噬菌体感染逝世而影响酸奶出产的问题。2007年,他们经过试验证明CRISPR体系确实是一种适应性免疫体系。嗜热链球菌被病毒侵略后,整合了来自噬菌体基因组新的距离序列,相同的病毒再次侵略时细菌就有了反抗进犯才能而Cas9蛋白或许是发生这种免疫才能所必需的。这是初次在试验上证明了CRISPR-Cas是一种细菌获得性免疫体系。

CRISPR-CAS的作用机制证明

CRISPR-CAS生物学功用的证明,使得许多研讨团队认识到这一体系的重要性,随后许多研讨团队纷繁开端弥补CRISPR-Cas体系搅扰噬菌体机制的细节。2008年,John van der Oost研讨小组在大肠杆菌中发现,来自噬菌体的距离序列被转录成小RNA,成为CRISPR RNA,并引导Cas蛋白到靶DNA上。Marraffini和Sontheimer在同年证明了CRISPR-Cas体系的方针分子是DNA,而不是RNA。他们还明确指出,咱们将该体系转移到非细菌体系中,或许成为一种强壮的东西体系。这为随后的基因修改埋下了伏笔。

2010年12月,Moineau团队证明了CRISRP-Cas9在PAM序列上游方位的精确切开使DNA双链断裂。而作为II型CRISPR体系的明显特征,Cas9是切开仅有需求的蛋白,它与crRNAs一起介导CRISPR-Cas9的搅扰功用。

2011年,Charpentier研讨组对酿脓链球菌进行了小RNA测序,发现除了crRNA以外,还存在一种小RNA,称为式激活CRISPR RNA。tracrRNA经过24个核苷酸与crRNA中的重复序列互补配对与形成双链,引导Cas9到靶DNA。至此,天然CRISPR-Cas9搅扰机制的拼图根本拼搭完好。

CRISPR-CAS基因修改技能的呈现

2012年Charpentier和Doudna团队协作,不只证明Cas9具有切开DNA双链的才能,还能够将tracrRNA和crRNA链接成sgRNA,并在体外试验中证明了sgRNA也能够辅导Cas9蛋白完成对DNA的双链剪切。他们能够经过改动crRNA的序列操控Cas9的靶向位点。随后Siksnys团队也报告了相同的发现。这一发现不只是细菌获得性免疫体系范畴的里程碑,更敞开了CRISPR-CAS基因修改技能的新篇章。很快,2013年头的多篇论文都将CRISPR-Cas体系成功地运用到了哺乳动物细胞中。其间,Church研讨组规划了II型CRISPR-Cas体系,在人293T细胞、K562细胞以及诱导多能干细胞中经过规划sgRNA成功靶向特定序列,且多个gRNA能够完成对方针基因的多重修改。张锋试验室证明了CRISPR-Cas9体系能够在人类和小鼠细胞中进行精确的定点切开,而且将Cas9骤变为缺口酶,促进同源修正过程。Qi研讨组则建立了CRISPRi体系,还完成了多sgRNAs 靶向多基因 (Tet1、Tet2、Tet3、Sry 和Uty) 的一起定点骤变。Wu等人运用CRISPR-Cas9体系对Crygc 显性骤变的小鼠进行基因医治使其获得了健康的子孙,为CRISPR-Cas9 体系用于遗传疾病的基因医治供给了根据。

由此,CRISPR体系在多种生物的基因定点修改、基因组挑选、基因转录调控、基因组成像、基因医治、生态运用等范畴的研讨与运用开端井喷。随后几年,张锋试验室更将CRISPR-CAS的基因修改体系进行了拓宽,不只发现了在特异性和多基因修改方面都有着很大优势的CRISPR-Cas体系:CRISPR-Cpf1,还发现具有RNA酶功用的CRISPR酶Cas13a和Cas13b。2017年,有多篇文章研讨了CRISPR-Cas13体系的作用机制、在临床确诊中的运用以及在哺乳动物细胞靶向RNA的才能。

3. CRISPR 基因修改技能的运用

CRISPR技能迅速开展使得它在转化医学和疾病医治范畴中的运用不断创造出惊喜。2015年Science杂志宣布了成功运用CRISPR医治遗传性疾病动物模型的办法。他们运用CRISPR体系修改Dystrophin基因,能够不同程度修正杜氏肌营养不良症小鼠的肌肉功用,然后到达医治DMD的作用。2018年有研讨证明运用CRISPR技能成功医治了四只患有DMD的狗,并将其肌肉和心脏安排中的营养不良蛋白康复到正常水平的92%。此外,CRISPR技能还与细胞免疫疗法相结合以完善CAR-T疗法,并在小鼠中增强了肿瘤抑制作用。初次运用CRISPR-Cas9在T细胞中敲除PD-1基因的临床试验已被同意用于医治肌肉浸润性膀胱癌、去势反抗性前列腺癌、转移性肾癌和转移性非小细胞肺癌,并在2016年开端了I期临床试验。

4. CRISPR的其他运用

现在,CRISPR 并不止在基因组修改得到了运用,在基因检测方面也展示了巨大的潜力。在2017年Science宣布的研讨中,Doudna 团队发现了一个很风趣的现象:CRISPR 体系在剪切靶向的双链 DNA 的一起,Cas12 的 DNA 酶活性会被激活。这个发现为检测细胞内是否含有某意图DNA 供给了一个全新的思路:一起向细胞内投递靶向该 DNA 的 CRISPR-Cas12a 体系和非特异性 ssDNA 荧光报告基因,一旦检测到意图 DNA,CRISPR-Cas12a 体系将发动,与此一起,荧光报告基因也会被降解,然后释放出荧光信号。运用这一技能,Doudna 团队开发了DETECTR体系,能够在一小时内100%精确检测出 HPV 16 感染,且单次测验本钱不到一美元。与此一起,张锋团队也运用CRISPR-Cas13a开发出了SHERLOCK体系和SHERLOCKv2体系,与Doudna团队不同,张锋团队规划的荧光报告基因有必要是特异性,也正是“特异性”这个长处使得 SHERLOCKv2 能够一起检测多种序列。张锋团队还开发了相似验孕棒的试纸检测办法,只需一张试纸,SHERLOCKv2 就能显示出病毒感染的检测成果,这使得检测更为便当。在本年COVID-19的检测技能开发中,SHERLOCKv2也曾一显身手。

尽管现在 DETECTR 和 SHERLOCK 已向咱们展示出它们在确诊中的强壮力气,但是在进入临床运用前,为了保证确诊的精确性,研讨者们依然需求做很多的作业。咱们信任这些新的确诊东西必将改写未来的确诊技能,尤其是为那些卫生条件相对较差、病毒高发的开展中国家在病毒感染确诊上带来巨大的协助。

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